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應用跨領域技術研究主纖毛新生的分子機轉

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應用跨領域技術研究主纖毛新生的分子機轉

  主纖毛是一個細胞內不可或缺的構造,目前已知纖毛的結構或功能異常會造成許多疾病,又稱ciliopathy,顯示研究纖毛形成及功能維持的重要性。主纖毛的形成只會出現在細胞週期的G0及G1時期,且已知在主纖毛的形成過程中,Tau微管蛋白激酶2(TTBK2)的激酶活性對主纖毛的初始化扮演著必需作用,但截至目前為止,科學家們卻尚未找到在主纖毛的初始化過程中會受到TTBK2調控的磷酸化的受質蛋白。在本實驗室,我們透過細胞生物學、分子生物學與超解析度顯微鏡影像的分析,發現中心粒頂端的蛋白CEP83在纖毛生成時其磷酸化扮演重要的角色。首先,我們藉助超解析度顯微鏡的協助觀察到TTBK2在主纖毛生成時,其蛋白在中心粒的位置會發生位移,從原本遠離CEP83變得靠近CEP83。接著我們也證實TTBK2會磷酸化CEP83並找到其磷酸化位點,最後我們也證實CEP83的磷酸化會促進纖毛的生成,解開TTBK2如何藉由其激酶活性調控主纖毛新生的分子機轉。


  主纖毛是從細胞膜突出的一種特化結構。主纖毛在細胞中扮演訊息接收者的角色,能夠接收外在環境中化學和機械的信號,在細胞增殖上扮演非常重要的角色。主纖毛形成主要有兩個步驟,首先在中心體需要由結構蛋白:CEP164、SCLT1、CEP83、CEP89、FBF1和LRRC45去協助形成distal appendage。在形成的過程中,依序由CEP83連結SCLT1和CEP89,而後SCLT1再連結CEP164和LRRC45。透過超高解析度顯微鏡分析此結構蛋白生合成時,發現CEP83、CEP89、SCLT1和CEP164依序由內而外的位在distal appendage的主支架上。另外在主纖毛形成的過程中有一個重要的激酶TTBK2,在纖毛起始中,此激酶的活性扮演關鍵作用,然而到目前,對於生理上能成為TTBK2的受質蛋白尚未被發現。

TTBK2在主纖毛形成時會在中心粒上的位置會發生位移,原本遠離CEP83變成與CEP83訊號重疊
圖一:TTBK2在主纖毛形成時會在中心粒上的位置會發生位移,原本遠離CEP83變成與CEP83訊號重疊。

  首先,我們透過超高解析度顯微鏡分析主纖毛生長時,TTBK2在中心體的相對位置,在上視圖中,發現纖毛生長細胞的螢光訊號比未生長細胞來的明顯,且TTBK2的位置會從周圍移動到中心體中,形成較小的圓環繞在中心體,我們因此假設主纖毛在生長中TTBK2相對位置的改變是為了更靠近其受質,進而促進主纖毛的生長。我們比對之前中心體結構蛋白分析的影像,發現主纖毛生長時,TTBK2有更多的螢光訊號與中心體的結構蛋白CEP83疊在一起。因此,我們認為CEP83為TTBK2可能的受質。

圖二:CEP83是TTBK2磷酸化的受質蛋白
圖二:CEP83是TTBK2磷酸化的受質蛋白

  為了探索TTBK2和CEP83其激酶和受質關係,我們建立一套體外激酶測定系統,首先將TTBK2和CEP83從細菌中純化出來,並藉由體外激酶測定系統發現TTBK2能直接磷酸化CEP83,因此證明CEP83為TTBK2的受質。進一步利用質譜儀進行分析,當TTBK2 存在的狀況下,CEP83上出現四個磷酸化位點。接下來,我們利用基因編輯系統將CEP83上的磷酸化位點進行修飾使CEP83的磷酸化失活,並藉由體外激酶測定系統發現TTBK2無法磷酸化失活的CEP83,根據此結果發現, CEP83為TTBK2的直接受質。接下來,我們製作了磷酸化抗體,藉此去辨認內生性磷酸化的CEP83,我們觀察到主纖毛細胞中的磷酸化訊號比無主纖毛細胞中來的多,代表在主纖毛生長過程中TTBK2會促使CEP83的磷酸化。

圖三:CEP83的磷酸化會促進主纖毛的初始化
圖三:CEP83的磷酸化會促進主纖毛的初始化

  更進一步去探討CEP83與主纖毛生長的關係,我們在移除內生性的CEP83,透過超高解析度顯微影像技術分析,發現細胞在主纖毛起始化的過程中,液泡生合成的能力消失,證明CEP83對於主纖毛起始化中的液泡生合成扮演非常重要的角色。而後,我們在移除內生性的CEP83的細胞中,重新將正常的CEP83及磷酸化位點變異的CEP83送進移除掉內生性CEP83的細胞中進行觀察,磷酸化位點變異的CEP83分別為磷酸化失活(CEP834A)和磷酸化持續性活化(CEP83DEED)。結果中發現在纖毛生長時,當細胞表現CEP834A,細胞長出主纖毛的比例大幅下降。最後,我們的研究結果發現CEP83為TTBK2的受質,且TTBK2磷酸化CEP83對於主纖毛起始化過程的液泡生合成及去除CP110影響尤深。

圖四:TTBK2磷酸化CEP83促進主纖毛新生的分子機轉示意圖
圖四:TTBK2磷酸化CEP83促進主纖毛新生的分子機轉示意圖

 

 

 延伸閱讀-科技部(科技大觀園) 

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